Proteasomal Activity is Involved in Oocyte Meiosis and Cumulus Expansion during in Vitro Maturation of Porcine Oocytes.

0042032 - ÚŽFG 2007 RIV US eng C - Konferenční příspěvek (zahraniční konf.)
Yi, Y. J. - Nagyová, Eva - Manandhar, G. - Procházka, Radek - Šutovsky, M. - Park, C. S. - Šutovský, P.
Proteasomal Activity is Involved in Oocyte Meiosis and Cumulus Expansion during in Vitro Maturation of Porcine Oocytes.
[Proteasomová aktivita je nutná pro meiozu oocytů a expanzi kumulu během zrání oocytů prasete in vitro.]
39th Annual Meeting of the Society for the Study of Reproduction. Nebraska, 2006, s. 177.
[39th Annual Meeting of the Society for the Study of Reproduction. Omaha (US), 29.07.2006-01.08.2006]
Grant CEP: GA ČR GA305/05/0960
Grant ostatní: USDA-NRI Animal Reproduction 2002-35203-12237; University of Missouri-Columbia F21-C
Výzkumný záměr: CEZ:AV0Z50450515
Klíčová slova: oocyte meiosis
Kód oboru RIV: EB - Genetika a molekulární biologie

The 26S proteasome, a multicatalytic, substrate-specific protease, has been implicated in the regulation of meiosis during mammalian oocyte maturation. We examined the effect of specific proteasomal inhibitor MG132 on meiotic maturation and cumulus expansion during in vitro maturation (IVM) of porcine oocytes. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were cultured in the presence or absence of MG132 for the first 22 h of maturation in FSH and LH-supplemented medium, followed by 22 h of culture without hormones, with or without MG132. Concentrations of MG132 ranging from 10 to 200 μM were applied. Nuclear maturation and meiotic progression was monitored by DNA staining with DAPI. Proteasomes were detected in the germinal vesicle (GV) by immunofluorescence. A microfilament disruptor, cytochalasin E (10 μM ), was added to some groups to block cumulus expansion. Microfilament organization was visualized by using Alexa Fluor 488-phaloidin. The percentage of immature GV stage ova was higher in the presence of 10 μM MG132 after 44 h (27.7%) than in control (1.3%). The rates of immature GV-stage oocytes increased progressively with increased concentrations of MG132 (19.7, 36.4, 48.0, 60.7, 86.5 and 93.1 % at 20, 40, 80, 100, 150 and 200 μM MG132, respectively. Cumulus expansion was accompanied by an extensive rearrangement of microfilaments and breakdown of transzonal projections of cumulus cell in control COCs. The addition of 10 μM MG132 during IVM prevented cumulus expansion, reorganization of microfilaments, and withdrawal of transzonal projections. Cytochalasin E prevented cumulus expansion but not the breakdown of transzonal projections. The FSH/LH–induced synthesis of hyaluronic acid (HA), a major component of the cumulus extracellular matrix (ECM) in expanded COSs, was significantly reduced by MG132 (100 μM). Western blot analysis of inter-alpha trypsin inhibitor (IaI), a serum-component which plays a key role in ECM formation, revealed covalent transfer of heavy chains of IaI molecules to HA only in the absence of MG132. These data suggest that proteasomal activity takes part in process of IVM of porcine oocytes. Supported by USDA-NRI Animal Reproduction (#2002-35203-12237 to PS), Grant Agency of the Czech Republic (#303/05/0960 to EN) and F21C Program of UM-C (PS).

26S proteasom, multikatalytická substrátově-specifická proteáza, se účastní regulace meiozy během zrání savčích oocytů. Sledovali jsme vliv specifického inhibitoru proteasomu MG132 na meiotické zrání a expanzi kumulu během zrání oocytů prasete in vitro (IVM). Kumulus-oocytární komplexy (COCs) byly kultivovány s nebo bez MG132 v médiu s FSH a LH. Koncentrace MG132 se pohybovaly v rozmezí 10 až 200 μM. Jaderné zrání a postup meiozy byl monitorován pomocí barvení DNA s DAPI. Proteasom byl detekován v zárodečném váčku oocytů (GV) pomocí imunofluorescence. Cytochalasin E (10 μM ) byl přidán k některým skupinám oocytů za účelem inhibice expanse kumulu. Organizace mikrofilament byla vizualizována pomocí Alexa Fluor 488-phaloidinu. Podíl nezralých oocytů ve stádiu GV stage byl vyšší v přítomnosti 10 μM MG132 po 44 h kultivace (27.7%) než v kontrolní skupině (1.3%). Podíl nezralých oocytů se zvyšoval progresivně s rostoucí koncentrací MG132 (19.7, 36.4, 48.0, 60.7, 86.5 a 93.1 % při 20, 40, 80, 100, 150 a 200 μM MG132, respektive. Expanze kumulu byla doprovázena intenzivní reorganizací microfilament a rozpadem transzonálních výběžků kumulárních buněk v kontrolních COCs. Přídavek 10 μM MG132 do media během IVM zabránil expanzi kumulu, reorganizaci microfilament a rozpadu transzonálních výběžků. Cytochalasin E zabránil expanzi kumulu ale neblokoval rozpad transzonálních výběžků. FSH/LH–indukovaná syntéza hyaluronové kyseliny (HA), hlavní složky extracelulární matrix (ECM) v expandovaných COSs, byla signifikantně redukována pomocí MG132 (100 μM). Western blot analýza inter-alpha trypsin inhibitoru (IaI), komponetny séra, která hraje klíčovou úlohu ve formaci ECM, odhalila kovalentní vazbu těžkých řetězců IaI molekuly k HA jen v médiu bez MG132. Tyto výsledky ukazují, že proteazomová aktivita se účastní procesu zrání oocytů prasete in vitro. Podporováno grantem USDA-NRI Animal Reproduction (#2002-35203-12237 to PS), Grantovou agenturou České republiky (#303/05/0960 to EN) a F21C Programem UM-C (PS).
Trvalý link: http://hdl.handle.net/11104/0135350