Efficient bacterial expression of recombinant potato mop-top virus non-structural triple gene block protein 1 modified by progressive deletion of its N-terminus

0028432 - ÚEB 2006 RIV US eng J - Článek v odborném periodiku
Pečenková, Tamara - Filigarová, Marie - Čeřovská, Noemi
Efficient bacterial expression of recombinant potato mop-top virus non-structural triple gene block protein 1 modified by progressive deletion of its N-terminus.
[Účinná bakteriální exprese rekombinantního nestrukturálního proteinu 1 z „triple gene blocku“ mop-top viru bramboru.]
Protein Expression and Purification. Roč. 41, - (2005), s. 128-135. ISSN 1046-5928. E-ISSN 1096-0279
Grant CEP: GA ČR GA522/04/1329
Výzkumný záměr: CEZ:AV0Z50380511
Klíčová slova: Protein expression * Potato mop-top virus * Triple gene block
Kód oboru RIV: EB - Genetika a molekulární biologie
Impakt faktor: 1.553, rok: 2005

To obtain strong bacterial expression of proteins that seem to be hard to express in bacteria or are highly toxic for bacteria, it is possible to vreate a palette of similar constructs, differing only by several nucleotides, gradually deleted from the full-lenght clone by ewonuclease III. When a construct is equipped with the 6xHis tag, a simple colony-blot procedure can be performed and a colony giving strong and efficient expression can easily sbe selected for high range protein expression. We utilized this procedure to produce one of potato mop-top virus (PMTV) movement proteins, namely triple gene block protein 1 (TGPp1) which was very hard toexpress in bacteria in its original length. The TGPp1 gene was digested with exonuclease III and nuclease S1 from its 5´ terminus. Leaving 6xHis tag intact. The clone that showed the strongest signal with anti-His antibodies in colony-blot procedure was found to have 44 amino acids (of total 463) deleted. The SDS-PAGE and Western blot of high range bacterial culture lysare confirmed the efficient expression of this deleted 6xHis tagged TGBp1 fragment.

Byla vypracována metoda pro expresi těžko exprimovatelných či toxických proteinů v bakteriích. Pomocí postupného zkracování exonukleasou III a nukleasou S1 z 5´konce se vytvořila škála podobných konstruktů lišících se pouze o několik nukleotidů. Konstrukty byly vybaveny 6 x His kotvou, která umožnila jejich detekci v colony- blotu. Pro expresi ve velkém měřítku se poté vybraly kolonie poskytující dostatečně silnou expresi. Tato metoda byla využita pro přípravu jednoho z nestrukturních „movement“ proteinů mop-top viru bramboru (PMTV) ( prvního proteinu z „triple gene block“ (TGBp1)).Klon, který vykazoval nejsilnější expresi byl zkrácen o 44 aminokyselin z celkových 463.
Trvalý link: http://hdl.handle.net/11104/0118373