New method of plant mitochondria isolation and sub-fractionation for proteomic analyses

0109145 - UEB-Q 20043068 RIV IE eng J - Journal Article
Hájek, Tomáš - Honys, David - Čapková, Věra
New method of plant mitochondria isolation and sub-fractionation for proteomic analyses.
[Nová metoda isolace a subfrakcionace rostlinných mitochondrií vhodná pro proteomické analýzy.]
Plant Science. Roč. 167, č. 3 (2004), s. 389-395. ISSN 0168-9452. E-ISSN 1873-2259
R&D Projects: GA MŠMT LZ1K03018
Institutional research plan: CEZ:AV0Z5038910
Keywords : plant mitochondria isolation * sub-fractionation * protein analysis
Subject RIV: EB - Genetics ; Molecular Biology
Impact factor: 1.389, year: 2004

A new method for the isolation and sub-fractionation of mitochondria from plant tissues is described. This method was used for the analysis of proteins isolated from a pure total mitochondrial fraction and of protein complexes obtained from two mitochondrial sub-fractions, membrane-bound and matrix, from in vitro cultivated tobacco pollen tubes. The method comprised: a new plant tissue homogenization procedure: differential centrifugation of the homogenates in a Percoll gradient; mitochondria immobilization together with Percoll removal by filtration through an uncharged nylon membrane. Mitochondria trapped on the nylon membrane were used for (1) rapid protein extraction; (2) quantitative phenol-chloroform protein extraction; (3) mitochondria sub-fractionation into membrane-bound and matrix fractions. The new method was found to be more efficient than previously published protocols, requiring the use of as little as 180 mg of fresh plant material. It is very fast, reliable, and suitable for proteomic analyses of plant organs and tissue samples with low biomass.

V článku popisujeme novou metodu isolace a subfrakcionace mitochondrií z rostlinných pletiv. Metoda byla úspěšně použita k analýze bílkovin získaných z celkové mitochondriální frakce a bílkovinných komplexů získaných z mitochondriálních subfrakcí, membránové a rozpustné, z in vitro kultivovaných pylových láček tabáku (Nicotiana tabacum). Popsaná metoda zahrnuje: nový způsob homogenizace rostlinného materiálu; diferenciální centrifugaci homogenátu v Percollovém gradientu a imobilizaci mitochondrií spolu s odstraněním Percollu filtrací přes neutrální nylonovou membránu. Mitochondrie uchycené na nylonové membráně byly použity pro (1) rychlou extrakci bílkovin; (2) kvantitativní isolaci bílkovin pomocí fenol/chloroformu a (3) subfrakcionaci mitochondrií na membránovou a rozpustnou (matrix) frakci. Popsaná metoda byla shledána účinnější než dříve popsané postupy zejména pro výrazně menší materiálovou náročnost (čerstvá hmotnost jen 180 mg). Postup je také rychlý, reprodukovatelný a vhodný pro proteomické analýzy rostlinných orgánů a pletiv s malým objemem biomasy.
Permanent Link: http://hdl.handle.net/11104/0016255