A fast and simple dot-immunobinding assay for quantifiction of mouse immunoglobulins in hybridoma culture supernatants

0105288 - UMG-J 20043035 RIV US eng J - Journal Article
Sulimenko, Tetyana - Dráber, Pavel
A fast and simple dot-immunobinding assay for quantifiction of mouse immunoglobulins in hybridoma culture supernatants.
[Rychlý a jednoduchý imunovazebný test ("dot-immunobinding assay") pro kvantifikaci myších imunoglobulinů v supernatantech hybridomových kultur.]
Journal of Immunological Methods. Roč. 289, - (2004), s. 89-95. ISSN 0022-1759. E-ISSN 1872-7905
R&D Projects: GA AV ČR IBS5052301; GA MŠMT LN00A026; GA MŠMT 1P04OE158
Keywords : dot-immunobinding assay * hybridoma culture superntatants * mouse immunoglobulins
Subject RIV: EB - Genetics ; Molecular Biology
Impact factor: 2.464, year: 2004

Mouse monoclonal antibodies of IgG subclasses and IgM class in hybridoma culture supernatants were quantified using a dot-immunobinding assay. Immunoglobulins were bound to nitrocellulose (NC) membrane and, after blocking, the membrane was incubated with anti-mouse antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP). Binding was revealed by incubation with a sensitive chemiluminiscence reagent. Quantitation was achieved by densitometric comparison with standard curves produced by purified monoclonal antibodies of the same subclass or purified antibodies of the same clone as the antibody to be quantified. These quantitative results were compared with those obtained using purified IgG from mouse serum or purified mouse myeloma IgM as standards. The dot-immunobinding assay requires 1 l of hybridoma culture sample and takes about 1 h in total. Good linearity between the staining intensity and the amount of immobilized immunoglobulins was observed over the range of 0.05ů5 ng/spot. The assay is simple, reproducible and can process simultaneously a large number of samples

Pomocí testu "dot-immunobinding" byly kvantifikovány myší monoklonální protilátky imunoglobulinové podtřídy IgG a IgM v supernatantech hybridomových kultur. Imunoglobuliny byly navázány na nitrocelulózovou (NC) membránu a po blokování byla membrána inkubována s protilátkou proti myším konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP). Vazba byla odhalena inkubací s citlivým chemiluminiscenčním reagentem. Kvantifikace bylo dosaženo denzitometrickým srovnáním se standardními křivkami získanými reakcí purifikovaných monoklonálních protilátek téže podtřídy či purifikovanými protilátkami téhož klonu jako kvantifikovaná protilátka. Tyto kvantitativní výsledky byly srovnány s výsledky získanými pomocí purifikovaného IgG z myšího séra či purifikovaného IgM myšího myelomu jako standardu. Pro test "dot-immunobinding" je třeba 1 l vzorku hybridomové kultury a trvá celkem asi 1 h. Mezi intenzitou zbarvení a množstvím imobilizovaného imunoglobulinu byla zjištěna dobrá linearita v rozpětí 0,05 ng/skvrna. Tento test je jednoduchý, reprodukovatelný a může současně zpracovávat velký počet vzorků
Permanent Link: http://hdl.handle.net/11104/0012534