Development of functional LH Receptors on pig cumulus-oocyte complexes cultured in vitro by a novel two-step culture system

0326146 - ÚŽFG 2010 RIV US eng J - Článek v odborném periodiku
Procházka, Radek - Němcová, Lucie - Nagyová, Eva - Scsuková, S. - Mlynarčíková, A.
Development of functional LH Receptors on pig cumulus-oocyte complexes cultured in vitro by a novel two-step culture system.
[Vývoj funkčních LH receptorů u prasečích oocyt-kumulárních komplexů kultivovaných in vitro novým modelem dvoustupňové kultivace.]
Molecular Reproduction and Development. Roč. 76, č. 8 (2009), s. 751-761. ISSN 1040-452X. E-ISSN 1098-2795
Grant CEP: GA ČR(CZ) GA523/08/0111; GA MZe QG50052
Výzkumný záměr: CEZ:AV0Z50450515
Klíčová slova: LH Receptors * oocyte
Kód oboru RIV: ED - Fyziologie
Impakt faktor: 2.041, rok: 2009

We show in the present study that freshly isolated pig cumulus-oocyte complexes (COCs) display a limited response to LH, as assessed by the expression of hyaluronan synthase 2 (Has2) mRNA, activation of protein kinase A (PKA), production of hyaluronic acid (HA) and progesterone, cumulus cell expansion and resumption of meiosis. These data indicate that freshly isolated COCs do not possess a sufficient number of functional LH receptors (LHR). However, the expression of Lhr significantly increased during the culture of COCs in vitro in a medium supplemented with FSH. Assuming that the effect of FSH on LHR induction is mediated via cAMP signaling pathways, we developed a new culture system, in which the COCs were pre-cultured for 72 h in a medium supplemented with dbcAMP. The pre-cultured COCs remained in the germinal vesicle stage, their cumulus investment underwent a dramatic increase in size and gap junctions between the cumulus cells were preserved. The stimulation of such COCs with either FSH or LH led to the resumption and completion of meiosis, activation of PKA, expression of Has2, synthesis of large amounts of HA and progesterone, and extensive expansion of cumulus cells. We conclude that the formation of functional LHR is stimulated in cumulus cells during the culture in vitro in a cAMP-dependent pathway. The dbcAMP-treated COCs thus represent a new model in which the resumption of meiosis and cumulus expansion can be induced exclusively by the action of recombinant LH.

V naší laboratoři jsme vypracovali metodiku dlouhodobé kultivace oocyt-kumulárních komplexů v médiu s dbcAMP, derivátem cAMP, který prochází přes cytoplazmatickou membránu buněk. Takto jsme schopni účinně blokovat zrání oocytů; 1 mM dbcAMP v kultivačním médiu udržel téměř všechny oocyty ve stádiu zárodečného váčku po dobu 72 h. Během kultivace si většina komplexů (65 až 75 %) zachovala trojrozměrnou strukturu a dramaticky zvýšila svou velikost díky intenzivní proliferaci kumulárních buněk. Blok meiotického zrání byl plně reverzibilní – oocyty zahájily meiotické zrání po odmytí dbcAMP a stimulaci pomocí FSH a dosáhly stádia metafáze II ve stejné frekvenci jako oocyty kontrolní (42 h bez dbcAMP). Zrání komplexů bylo doprovázeno intenzivní produkcí hyaluronové kyseliny a expanzí kumulárních buněk. Dále jsme studovali na molekulární úrovni procesy, které charakterizují komplexy kultivované dlouhodobě v médiu s dbcAMP. Prokázali jsme zvýšenou expresi LH receptorů na kumulárních buňkách, proliferaci kumulárních buněk a expresi steroidogeních enzymů, typickou pro nediferencované buňky. Teprve po stimulaci komplexů pomocí FSH, ale i LH došlo k terminální diferenciaci buněk, zvýšené expresi hyaluronansyntetázy 2, produkci hyaluronové kyseliny a progesteronu.Tyto výsledky ukazují, že během preinkubace komplexů v médiu s dbcAMP dochází k tvorbě funkčních LH receptorů na kumulárních buňkách, které se podílejí na regulaci zrání oocytů a expanze kumulárních buněk in vitro.
Trvalý link: http://hdl.handle.net/11104/0173345