0026469 - ÚEB 2006 RIV GB eng J - Článek v odborném periodiku
Doležel, Jaroslav - Bartoš, Jan
Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size.
[Analýza DNA pomocí průtokové cytometrie a stanovení velikosti jaderného genomu.]
Annals of Botany. Roč. 95, - (2005), s. 99-110. ISSN 0305-7364. E-ISSN 1095-8290
Grant CEP: GA ČR GA522/03/0354; GA ČR GA204/04/1207
Výzkumný záměr: CEZ:AV0Z50380511
Klíčová slova: flow cytometry * nuclear genome size * DNA C-value
Kód oboru RIV: EB - Genetika a molekulární biologie
Impakt faktor: 2.665, rok: 2005

Background: DNA flow cytometry describes the use of flow cytometry for estimation of DNA quantity in cell nuclei. The method involves preparation of aqueous suspensions of intact nuclei whose DNA is stained using a DNA fluorochrome. The nuclei are classified according to their relative fluorescence intensity or DNA content. Because the sample preparation and analysis is convenient and rapid, DNA flow cytometry has become a popular method for ploidy screening, detection of mixoploidy and aneuploidy, cell cycle analysis, assessment of the degree of polysomaty, determination of reproductive pathway, and estimation of absolute DNA amount or genome size. While the former applications are relatively straightforward, estimation of absolute DNA amount requires special attention to possible errors in sample preparation and analysis. - Scope: The article reviews current procedures for estimation of absolute DNA amounts in plants using flow cytometry, with special emphasis on preparation of nuclei suspensions, stoichiometric DNA staining and the use of DNA reference standards. In addition, methodological pitfalls encountered in estimation of intraspecific variation in genome size are discussed as well as problems linked to the use of DNA flow cytometry for fieldwork. - Conclusions: Reliable estimation of absolute DNA amounts in plants using flow cytometry is not a trivial task. Although several well-proven protocols are available and some factors controlling the precision and reproducibility have been identified, several problems persist: (1) the need for fresh tissues complicates the transfer of samples from field to the laboratory and/or their storage; (2) the role of cytosolic compounds interfering with quantitative DNA staining is not well understood; and (3) the use of a set of internationally agreed DNA reference standards still remains an unrealized goal.

Průtoková cytometrie DNA umožňuje stanovení množství DNA v buněčných jádrech. Metoda spočívá v přípravě suspenze intaktních jader jejichž DNA je barvena pomocí fluorochromu vážícího se na DNA. Jádra jsou klasifikována podle relativní intenzity fluorescence a tedy obsahu DNA. Díky tomu, že je příprava vzorku snadná a rychlá, průtoková cytometrie DNA se stala populární metodou pro analýzu ploidie, identifikaci mixoploidie a aneuploidie, analýzu kinetiky buněčného cyklu, stanovování rozsahu polysomatie, určení způsobu rozmnožování a stanovení obsahu jaderné DNA v absolutních jednotkách neboli velikosti genomu. Tento článek podává přehled postupů pro měření obsahu DNA u rostlin v absolutních jednotkách pomocí průtokové cytometrie s důrazem na přípravu suspenze jader, stechiometrické barvení DNA a použití standardů DNA. Dále diskutuje metodické chyby, které ovlivňují analýzu vnitrodruhové variability velikosti genomu a problémy s použitím průtokové cytometrie DNA v terénu. Přesné stanovení obsahu DNA v absolutních jednotkách není triviální úkol. Ačkoliv je k dispozici několik spolehlivých protokolů a řada faktorů ovlivňujících přesnost a reprodukovatelnost již byla identifikována, mnoho problémů přetrvává. Prvním z nich je požadavek na čerstvé vzorky, který ztěžuje přenos vzorků z terénu do laboratoře, případně omezené možnosti skladování vzorků. Vážným problémem je interference složek cytosolu na kvantitativní barvení DNA, která dosud nebyla objasněna. Dosud neuskutečněným cílem je mezinárodní shoda na sestavě standardů obsahu DNA.
Trvalý link: http://hdl.handle.net/11104/0116708